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规格:100管/96样
3-磷酸甘油醛脱氢酶说明书
微量法
测定意义
GAPDH催化3-磷酸甘油醛氧化生成1,3-二磷酸甘油酸,是糖酵解途径的关键酶,与糖异生途径、体内血糖浓度的维持和糖尿病的发生密切相关,在机体糖、脂、蛋白代谢紊乱疾病中发挥重要作用。
测定原理
3-磷酸甘油酸激酶催化三磷酸甘油酸和ATP生成1,3 二磷酸甘油酸。GAPDH逆向催化 1,3二磷酸甘油酸和NADH生成3磷酸甘油醛、无机磷和NAD,340nm处测定NADH的减少量可反映GADPH 活性的高低。
需自备的仪器和用品
分光光度计/酶标仪、恒温水浴锅、台式离心机、可调式移液器、微量石英比色皿/96孔板、研钵、冰和蒸馏水。
试剂的组成和配制
提取液:100mL×1 瓶,4℃保存;
试剂一:粉剂×1 瓶,-20℃保存;
试剂二:液体 20mL×1 瓶,4℃保存;
试剂三:液体×1 支,4℃保存;
样本的前处理
1、细菌或培养细胞:先收集细菌或细胞到离心管内,离心后弃上清;按照细菌或细胞数量(104个):提取液体积(mL)为500~1000:1的比例(建议500万细菌或细胞加入1mL提取液),超声波破碎细菌或细胞(冰浴,功率 20%或200W,超声3s,间隔10s,重复30次);8000g 4℃离心10min,取上清,置冰上待测。
2、组织:按照组织质量(g):提取液体积(mL)为1:5~10的比例(建议称取约0.1g组织,加入1mL提取液),进行冰浴匀浆。8000g 4℃离心10min,取上清,置冰上待测。
测定步骤
1、分光光度计或酶标仪预热30min以上,调节波长至340nm,蒸馏水调零。
2、样本测定
(1)工作液的配制:将试剂二全部倒入试剂一瓶中,充分溶解,37℃(哺乳动物)或 25℃(其
它物种)预热10分钟;现配现用。
(2)在试剂三中加入500μL蒸馏水,充分混匀待用;用不完的试剂 4℃保存一周。
(3)在微量石英比色皿或96孔板中加入5μL 样本、5μL试剂三和190μL工作液,混匀,加入最后一个试剂的同时开始计时,记录340nm处20s时的吸光值A1和5min20s后的吸光值A2,计算 ΔA=A1-A2。
GAPDH 活性计算
a. 用微量石英比色皿测定的计算公式如下
(1)按样本蛋白浓度计算
单位的定义:每mg组织蛋白每分钟消耗1nmol的NADH定义为一个酶活力单位。
GAPDH(nmol/min/mg prot)=[ΔA×V 反总÷(ε×d)×109]÷(V 样×Cpr) ÷T
=1286×ΔA÷Cpr
(2)按样本鲜重计算
单位的定义:每g组织每分钟消耗1nmol的NADH定义为一个酶活力单位。
GAPDH(nmol/min/g 鲜重)=[ΔA×V 反总÷(ε×d)×109]÷(W×V样÷V样总) ÷T
=1286×ΔA÷W
(3)按细菌或细胞密度计算
单位的定义:每1万个细菌或细胞每分钟消耗1nmol的NADH定义为一个酶活力单位。
GAPDH(nmol/min/104cell)=[ΔA×V反总÷(ε×d)×109]÷(500×V样÷V样总) ÷T
=2.57×ΔA
V 反总:反应体系总体积,2×10 -4 L;ε:NADH摩尔消光系数,6.22×10 3 L/mol/cm;d:比色皿光径,25px;V 样:加入样本体积,0.005 mL;V 样总:加入提取液体积,1mL;T:反应时间,5 min;Cpr:样本蛋白质浓度,mg/mL;W:样本质量,g;500:细菌或细胞总数,500 万。
b.用96孔板测定的计算公式如下
(1)按样本蛋白浓度计算
单位的定义:每mg组织蛋白每分钟消耗1nmol的NADH定义为一个酶活力单位。
GAPDH(nmol/min/mg prot)=[ΔA×V 反总÷(ε×d)×109]÷(V 样×Cpr) ÷T
=2572×ΔA÷Cpr
(2)按样本鲜重计算
单位的定义:每g组织每分钟消耗1nmol的NADH定义为一个酶活力单位。
GAPDH(nmol/min/g 鲜重)=[ΔA×V反总÷(ε×d)×109]÷(W ×V样÷V样总) ÷T
=2572×ΔA÷W
(3)按细菌或细胞密度计算
单位的定义:每1万个细菌或细胞每分钟消耗1nmol的NADH定义为一个酶活力单位。
GAPDH(nmol/min/104cell)=[ΔA×V反总÷(ε×d)×109]÷(500×V样÷V样总) ÷T=5.144×ΔA
V 反总:反应体系总体积,2×10-4 L;ε:NADH 摩尔消光系数,6.22×103 L/mol/cm;d:96 孔板光径,12.5px;V 样:加入样本体积,0.005 mL;V 样总:加入提取液体积,1mL;T:反应时间,5 min;Cpr:样本蛋白质浓度,mg/mL;W:样本质量,g;500:细菌或细胞总数,500 万。